踏入清代，澳门海上贸易航线面临一系列危机︰首先，日本德川幕府于1630年代宣布“锁国”政策，禁止葡萄牙人和西班牙人进行贸易和传教。其后，葡萄牙于1640年因脱离西班牙的统治，使澳门与马尼拉的航线中断；翌年，葡萄牙人还失去极为重要的马六甲港，大大打击葡萄牙人在东南亚和远东的贸易。失去日本、马六甲和马尼拉，使澳门的贸易大不如前，但更为雪上加霜是清初实施海禁和迁界令，令葡萄牙人在澳门一度无法进行贸易。
直到康熙二十三年（1684）迁海令撤销，才使澳门的贸易恢复起色。翌年，清廷下令设立四大海关（粤海关、江海关、闽海关、浙海关），并在澳门设立“关部行台”管理外国贸易。有别于明朝透过葡萄牙人居中买卖，康熙皇帝允许其他外国商团到中国贸易，包括新与的英国和法国商人。乾隆十六年（1751），由于外商来华贸易频繁，为了方便管理，清廷只保留广州作唯一的通商港口，外商可在贸易季节在广州经商，其后必须离开，但允许在澳门“住冬”，使澳门成为各国外商的居留地。
除了贸易上的大转折，清朝对天主教的态度也有所改变。初期不乏耶稣会士在朝廷为满清皇族服务，如任钦天监的汤若望、任宫廷画师的朗世宁等。清初对天主教抱持相对包融的态度，但在18世纪初发生“礼仪之争”，使清廷与罗马教廷之间出现严重分歧，致使雍正和乾隆年间，朝廷开始实施禁教，甚至派员到澳门拆毁教堂，天主教在内地的传教事业大受打击。
鉴于在澳门是“夷人”聚集地和天主教传播的基地，加人华洋的交流日渐频繁，时常出现大大小小的纷争，清廷对澳门的管理也较明代加强，不仅颁布多项章程来规限“澳夷”，同时派遣“澳门同知”和“香山县丞”加强对居澳葡萄牙人的管治。