仁慈堂博物馆位于议事亭前地仁慈堂右巷2号的仁慈堂大楼内，通过一条花园小巷抵达正门，沿着楼梯拾级而上即可到达。整座大楼约建于18世纪，19世纪时曾改建，1905年始成今天的规模。两层高的建筑为新古典主义风格，以白色为主色，属于澳门慈善机构仁慈堂的物业，而2005年整座建筑以澳门历史城区之名被列入《世界遗产名录》内。仁慈堂原名“圣母慈善会”，是葡萄牙的民间慈善团体，由葡萄牙王后莲娜于1491年8月15日在里斯本创办。到1569年，葡籍传教士贾尼路创办澳门仁慈堂，成为澳门最早的慈善机构，经常赈济寡妇、孤儿、贫病老人，并开办了中国第一间西式医院——白马行医院（医院初名为“贫民医院”，俗称“医人庙”，1974年结业），还在会下设有育婴室、痲疯院和老人院等机构。过往仁慈堂在中国文献中被称为“支粮庙”，“支粮”是指它属下机构员工到该处领取薪金，而“庙”则是由于过往仁慈堂内设有圣堂，包括祭坛及圣像，犹如小教堂般，故合称为“支粮庙”。仁慈堂大楼1楼曾为澳门政府第一公证处（2016年迁往黑沙环政府综合服务大楼），转角处有一历史石碑，是澳门市政厅1998年3月在罗结地巷1号发现的1569年仁慈堂附属孤儿院石碑，2楼则是仁慈堂博物馆，于2001年12月14日正式揭幕，门票的收益将用作仁慈堂的慈善用途。博物馆内藏品以宗教或与仁慈堂发展历史有关的物品为主，共有300多件，大部分均是来自仁慈堂值理会主席飞安达的私人珍藏，当中的瓷器展品对研究中国明清时期的外销瓷，有很高的参考价值。而最令人注目的展品是一部1627年草拟通过，1662年写成的《澳门仁慈堂章程》手抄原件，内里甚至连首页的宗教人物图案亦是手绘，它是该堂最早、保存最久的历史文献。其他较为突出的展品还有：创始人贾尼路主教的头颅遗骨以及当年陪葬的十字架、贾尼路主教的全身油画像、19世纪耶稣圣心像、18世纪葡属印度时期的圣母及耶稣雕塑、前白马行医院的铜钟及众多印有耶稣会徽号（JHS）的陶瓷器皿等。这些展品不仅反映了仁慈堂在东西方文化交汇过程中所担当的角色，同时亦反映出天主教东传亚洲并在邻近地区衍生的文化特色。主展厅的左方是一间会议室，内里墙壁挂放着捐赠人的画像，无论一枱一椅都仍保留了20世纪典雅的布置风格。从会议室往外走即能通到2楼的白色外廊，这里摆放着墨绿色的桌椅，此外还有旧式的风扇在缓缓转动。由外廊近窗处俯瞰便可看到有着黑色波纹状图形的议事亭前地一带及喷水池景色。

澳门仁慈堂（Santa Casa da Misericórdia de Macau）是由早期葡萄牙传教士在澳门创办的慈善公益机构。仁慈堂起源于葡萄牙。1498 年，葡萄牙女摄政王唐娜．莱昂诺尔（Leonor de Viseu, 1458–1525） 在里斯本创立向穷人提供援助的仁慈堂。此后，葡萄牙各海外属地以至世界各地纷纷建立仁慈堂。澳门仁慈堂就是仿照葡萄牙仁慈堂模式而成立的。1568 年，葡萄牙耶稣会士贾耐劳（D. Belchior Carneiro, 1516–1583）抵达澳门，眼见澳门的孤寡贫民生活无依，有些更染上痳疯病，因此，他于次年（1569年）创办了澳门仁慈堂。