鸦片战争后，澳门的贸易的地位受到威胁，葡萄牙皇室对澳门进行殖民化，强行推出“自由港”政策，试图改变困境。1846年，澳门总督亚马留上任后，以强硬手段推行殖民统治，包括向华人征税、向城外村落扩张，以及破坏清朝对澳门的管治权，使澳葡政府与清朝陷入紧张关系。直到1852年，葡萄牙政府采取让步，双方的关系才有所缓和，但葡萄牙人并没有放弃控制澳门。在1864年，澳葡政府借着清朝在英法联军之役大败，草签了《中葡和好贸易条约》，试图让清朝承认葡萄牙对澳门的控制权，及后因修改条约出现分歧而没有成为有效的法律文件。
尽管签约未果，澳葡政府仍然向望厦、龙田、沙梨头、塔石、凼仔和路环进行扩张。直到1887年，清朝与葡萄牙再次就澳门的管治权进行谈判，签订《中葡友好通商条约》，承认葡萄牙人“永居”澳门，但澳门的地界问题仍未解决，并展开新一轮的争议。
在澳葡政府的统治下，葡萄牙人推出专营承充制来增加收入，并把苦力贸易、赌业、鸦片贸易等纳入其中，这些行业曾一度成为政府的收入来源。另外，拥有较多财富的华商参与政商活动，他们不仅参与土地开发和推动工业，也组织本地的慈善机构为居民服务。
19世纪末、20世纪初，中国人民反抗列强侵略、拯救民族危亡之际，改良变革思潮风起云涌。澳门由于其邻近广东的地理位置和受葡人管治的政治环境，为维新派、革命派的活动提供了特殊的空间。郑观应、康有为、梁启超都曾在澳门积极开展活动，而中国民主革命先行者孙中山也在不同时期以澳门为基地，开创革命事业。