明嘉靖十四年（1535），广州市舶提举司舶口迁至澳门，澳门自此成为一个朝廷派有官员管理的对外口岸，走出开埠的第一步。
在欧亚大陆另一端，葡萄牙自15世纪初开始海上扩张，逐步到达南非好望角，占领果阿、马六甲，并试图与中国建立直接商贸联系。1513年（明正德八年），欧维治（Jorge Álvares）成功航行至珠江口的屯门，成为第一个抵达中国的葡萄牙人。但早期葡萄牙在华经贸并不顺利，只能在广州外海一带暗中非法贸易，但交通不便，水土甚恶，开始频密光顾澳门。据《澳门记略》称︰“三十二（1553）年，蕃舶托言舟触风涛，愿借濠镜地曝诸水渍贡物，海道副使汪柏许之。初仅茇舍，商人牟奸利者渐运瓴甓榱桷为屋，佛郎机遂得混入。高栋飞甍，栉比相望，久之遂专为所据。蕃人之入居澳，自汪柏始。”
澳门开埠后，迅速成为东亚的贸易港口，一方面连接从欧洲至中国的贸易航线（里斯本—果阿—澳门），另一方面也连接与日本长崎的贸易。当葡萄牙入并西班牙时，从墨西哥至菲律宾到澳门的贸易航线也随着开通。在15世纪末至16世纪初期，中国货物如瓷器、茶叶和丝绸，经澳门出口至日本、东南亚、印度、非洲、欧洲及美洲；而明朝则从贸易中换取国内稀缺的白银。
除了贸易之外，天主教传教士也随船来到远东，向这片新天新地传播福音。澳门开埠后不久，耶稣会最为热衷于传教工作，他们在城内建造圣安多尼堂、圣老楞佐堂和圣拉匝禄堂（望德圣母堂），并组织中国和日本传教的工作。其后，方济各会、道明会和奥斯定会亦纷纷在澳门立足。在1576年时，罗马教廷颁令成立澳门教区，负责管理中国、日本、越南等地的事务，其范围包含远东和东南亚地区。在天主教传入中国的过程中，耶稣会传教士一方面把西方技术传到中国，另一方面把中国的经典翻译带回欧洲。澳门不但是远东的传教中心，也在文化上担当交流平台的角色。
随着城市渐渐发展起来，居澳葡人在萨主教（D. Leonardo de Sá）的倡议和主持下，于1583年组织议事会。议事会获葡萄牙国王认可，享有政治、司法和行政权，对澳门城内的葡萄牙人进行管理。不过，葡萄牙皇室在1623年派遣“澳门总督”，不仅能行使军事权力，同时也获授予一定的司法权和财政权，促使议事会和澳门总督的关系时常处于紧张状态。另外，明朝仿傚“番坊”的模式对澳门城进行管理，由香山知县与议事会进行联络，管理澳门的事务。同时，明朝也在1574年在“莲花茎”上设立关闸，既是控制华夷的往来，也掌控澳门城的物资，使葡萄牙人服从于明朝。
踏入十七世纪，澳门的贸易地位吸引其他欧洲国家的争夺，包括后起的荷兰东印度公司。1622年，荷兰东印度公司组织一支远征军，试图从葡萄牙人手上夺取澳门城，但葡萄牙人却成功抵御荷兰人的攻势。然而，随着荷兰东印度公司在亚洲的扩张，他们渐渐取代葡萄牙人的势力，加上清初的贸易政策，使澳门的贸易走向衰落。
