海事博物館由海事及水務局（前身為港務局）管理，前身是1919年在港務局大樓內的“海事及漁業博物館”，當年主要展出的是各類捕魚繩網、船隻模型及簡單的航海用品。到1934年該館遷往外港的空軍飛機庫時，藏品已增加了船塢模型、各式船上用品以及數百個魚類標本等。但不幸的是，該博物館在1945年1月16日因被懷疑飛機庫內儲有日軍汽油而遭美軍空襲，藏品悉數盡毁。

1986年，時任港務局局長蘇勵治提出於媽閣廟前地建立海事博物館，該建議旋即得到批准，並於1987年竣工正式對外開放（即現在媽祖閣旁的行政大樓），後來隨着館藏愈來愈豐富及參觀人數的增加，政府決定修建新大樓。1990年6月24日，全新的博物館開幕，總面積為2,400平方米，展覽面積1,000平方米，外形似一艘揚着白帆的三桅船，主要分為海事博物館主體展樓、水族館、露天茶座和以海事為主題的附屬圖書館（此圖書館不在博物館內）4部分。

至於海事博物館主體展樓就建在當年首批葡萄牙人登岸的地方，高3層，首層與2層之間有一小閣樓，而2層及3層為半開放式建築設計，站在小閣樓即可看到2層和3層部分展區。這種開放式的設計使得整體空間變得開闊，無絲毫的侷促感，且預先知曉2層及3層的部分展覽內容更能增強參觀者的觀看意欲。單從建築學的角度來看，澳門海事博物館內外設計獨特，本身已是一件藝術品，但要發掘澳門海事博物館的內涵還得從每層樓的特色展區及每件展品去細細品味。

從正門步入海事博物館，入口的右邊是一幅以海員船上作業為主題的石雕壁畫，壁畫的右邊以葡、中、英3種文字書寫：“1990年6月24日開幕，為獻給建立世界各國人民友誼的航海先驅而建。 ”

繞過壁畫，往裡走，便是“海事民俗展覽廳”，展廳最能吸引目光的是左邊的魚欄模擬場景，兩位看家的阿公、阿婆都是實物比例模型。在展區內順時針參觀，魚欄隔壁就是泥灘作業的情況介紹，這裡展示了作業工具泥板的實物及蠔的生長情況。再往上是個小閣樓，陳列了漁民幾種服飾以及“澳門漁民家庭”的模擬場景，配有語音介紹。由小閣樓下來繼續走首層的展區，將看到一連串豐富的展覽內容：不同類型船隻的模型、南中國魚類、捕魚場及大帆船廠模型、造船工具實物等等。整個展室的中央則是以軸葉式的展板介紹了澳門各大節慶的情況以及節慶的典型用具。在離開展區之前還可以走入音像視聽室瞭解“媽閣的故事”，備有葡語、粵語、普通話及英語講解。

走出展室便是紀念品售賣部，出售以博物館為題材的書籍，此外亦有一些由博物館自設工場製造的船隻模型。沿着紀念品部旁的樓梯走上梯間的小閣樓，是一個獨立的展區，這裡展出了一批葡萄牙傳統船隻模型，還配以3種語言介紹相關的內容。

由小閣樓步上第二層，是“海事歷史展覽廳”，這裡陳列了中國古代的戰船及商船模型，還具體展示了商船上運載的商品，如茶、薑、肉桂等。而中國古代航海歷史中最重要的部分——鄭和下西洋，當然也納入了展覽內容。展區的其餘部分還介紹了葡萄牙航海歷史、經“果亞—馬六甲—澳門—日本”的大黑船以及17世紀澳門立體地圖。可以說這裡已不再單單呈現了大航海時代的海事，還構築了一個個昔日湛藍而無邊的夢。

第三層為“海事技術展覽廳”，主要介紹了潮汐測量、航海信號、現代船隻模型（主要是澳門至廣州和香港的客輪模型，包括蒸汽輪到噴射船）、挖泥機和濬河開發以及現代軍事戰船等等。這層最吸引人的便是模擬北半球星座天空的天幕設計，只要按一下星座按鈕，相應的星座就在頭頂蔚藍的螢光穹宇上閃爍，十分有趣。

從第三層後樓梯下行至位於第二層的獨立式展館——“水族館”，這個館的主角當然是顏色鮮艷、五彩斑斕的珊瑚魚，另外這裡還展示了濕地鳥類的模型以及各種貝殼類的標本，以滿足參觀者對海洋及濕地生物的求知欲。水族館的下一層就是露天茶座，茶座面對媽閣廟，臨近十字門水道，環境優美，茶座的地面設計類似中國古代指南針，頗具特色。

海事博物館的附屬圖書館擁有約2,500冊書籍，類型包括海事技術學、海事民俗學、葡萄牙及中國海事歷史、船隻的建造、模型製造和水族學等等。值得注意的是這裡還有相當數量的圖片和圖則，其中包括1920年至近期有關海事的底片和一些古老的葡萄牙大型船隻的圖則，對澳門的海事研究，可謂彌足珍貴。除此之外，海事博物館多年來亦出版了為數不少有關海事與水上風俗的研究著作，如《澳門魚類》、《澳門水面醮與朱大仙信仰》等，引起學術界的注意。