朱印船即指1592年（明萬曆二十年）至1639年（明崇禎十二年）間持有幕府將軍朱紅印執照、可以從事海外貿易的日本商船。1608年11月30日， 一艘日本“朱印船”的船員在澳門的碼頭上與葡萄牙人發生糾紛，接着，他們上岸尋釁，打傷了前來勸解的澳葡官員。澳葡中日貿易船隊司令佩索阿（André Pessoa）和憤怒的士兵、市民一起進行反擊，殺死、俘獲近百名日本船員。1609年秋，消息傳到日本，日本政府決定懲罰正在長崎進行貿易的佩索阿。他們調集軍隊於1610年1月3日對佩索阿的船隊發動圍攻。戰鬥持續四日，直到1月6日晚，最後，佩索阿點燃船上的火藥庫將自己連同價值上百萬的金銀和近3000擔生絲全部炸沉海底，事件遂告平息。

17世紀初澳葡守軍擊敗荷蘭海軍進犯澳門的一場戰鬥。葡人來澳不久，荷蘭亦覬覦澳門。1601年（明萬曆二十九年），荷蘭數次向明政府提出借地通商的要求，均被拒絕。又於1601年和1604年兩次進攻澳門，均未成功。1622年（明天啟二年），荷蘭大舉侵澳，出動巴達維亞8艘戰艦，並聯合艦長苗活的4艘戰艦，配備巨炮60門，士兵1000人，由荷蘭提督賴啫臣（Kornelis Reyerszoon）統率，於6月10日出發，直奔澳門。6月21日，荷艦抵澳門海面。當時澳門守備力量僅50名火槍兵，100多名能執武器的土生葡人和三座配備不全的炮台。6月24日破曉，荷蘭軍艦猛轟嘉思欄炮台，炮台守軍全力回擊，當即擊毀一艘。賴啫臣即率800名精鋭部隊在劏狗環一帶登陸，葡軍憑藉新挖戰壕向荷軍反擊，賴啫臣腹部中彈返回，命盧芬（Hans Ruffijn）代他指揮。荷軍在盧芬上校的指揮下很快佔領龍環村、龍田村一線，被大龍泉、二龍泉匯合的坑水阻擋。葡方的伯多祿炮台發炮轟擊，命中荷軍火藥車，使荷軍死傷慘重。這時，澳葡中日貿易船隊司令薩門托（Lobo Sarmento de Carvalho）也親臨前線，並發出反攻命令，葡軍、市民、修道士及黑奴們一起出擊，特別是黑奴作戰勇敢，奮不顧身，當場擊斃盧芬，荷軍全面崩潰。是役，荷軍死136人，傷126人，其中11名校級軍官，死傷的日本人和印尼人也達數百人，還有一名上校及一批士兵被俘。葡方傷亡極輕。澳門葡軍獲得了完全的勝利。為了紀念這一空前大捷，澳葡當局將6月24日定為澳門城市日。

明朝官員強行拆除澳葡當局在澳門非法修築城牆的案件。1623年（明天啟三年），澳葡當局沒有獲得明朝政府的允許，藉口防禦荷蘭的進攻，在水坑尾三巴門間，建築了一道城牆。城牆起於今西望洋山聖母堂附近，分東西兩翼延伸，東翼城牆循東面山坡一直到燒灰爐台止；西翼城牆，則分南北兩幅，南幅止於西望洋山聖母堂的西南山脊，北幅一直伸到媽閣廟的海鏡石。明朝政府對於葡人的這種越權非法行為採取了堅決的行動，廣東海道副使徐如珂首先通知澳葡當局拆毀這道城牆，澳葡不聽。徐如珂即派中軍領兵進駐澳門，自己也隨軍前往，並命令軍隊拆毀城牆。不到兩天，城牆全部拆毀，澳葡不敢反抗。原城牆下的媽閣斜巷等街道，後人俗稱為“萬里長城”。

1580年（明萬曆八年），居澳葡萄牙人擅自選舉首席法官，並在當地實施葡萄牙法律。1582年新任兩廣總督陳端奉朝廷之命，前來查辦這一事件。陳瑞先傳令澳葡地方長官，即中日貿易船隊司令米蘭達（Aires Gonsalves de Miranda）和薩（D. Leonardo de Sá）主教，前往兩廣總督駐地肇慶。澳葡派出與中國官員關係密切的司法官本涅拉（Mattia Penella）和傳教士羅明堅（Michele Ruggieri）作為代表去與總督周旋。在參見陳瑞時表示，居澳葡人無論是過去還是現在總是中國皇帝的順民，並承認兩廣總督殿下是他們的保護者，懇請總督對他們加以扶助及慈愛。接着又把隨身帶去的一批天鵝絨、水晶鏡等總值超過1000金幣的厚禮送給陳瑞。於是陳瑞便吿訴他們可以在澳門繼續居留，但必須服從中國官員的管轄。

1661年（清順治十八年），清政府為消滅台灣鄭成功率領的抗清武裝，決定實行海禁，封鎖台灣，並頒佈遷海令，將粵、閩、浙等沿海地區居民遷入內地30里或50里。澳門亦在內遷之列。1662年，澳葡當局接到夷平各個炮台，以免被鄭成功佔據的命令。後因順治皇帝身邊的傳教士湯若望、龐迪我等人請願斡旋，一再申稱“澳門有功於國”，並表示葡萄牙人自己能夠對付“海盜”，才使清政府收回成命，並將香山縣遷海之界線就劃在前山寨、北山、閘口一帶，澳門半島始獲免遷。由於實行海禁，澳門反而受益，得以對外開放，繼續對外貿易，成為中國保持對外貿易聯繫的一個主要港口。

1724年（清雍正二年），滿清政府大規模驅逐西洋傳教士，澳葡政府擔心清廷會進而收回澳門，就上書請求葡萄牙國王若奧五世遣使來華。1727年，葡國使臣麥德樂（Alexandre Metelo de Sousae Menezes）經澳門抵達北京，朝覲雍正皇帝，行三跪九叩禮，呈獻大量禮物，並懇請清政府保護在澳門和中國內地的葡人。雍正允准了這一請求，同意葡人繼續居留澳門，並在麥德樂返澳時，給予了特別的優待。這次出使費用浩大，在澳葡萄牙人共拿出了3萬両銀子，其中澳葡當局承擔了2.5萬両。

1574年（明萬曆二年），明朝政府在澳門半島與內地相連的沙堤——蓮花莖的中段（今關閘馬路中段），設置關閘一事，史稱“莖半設閘”。此座中式城樓形式的關閘，位於澳門與內地之間的險要處，扼內地通往澳門的陸上咽喉。開始時每5日開啟一次，設官兵把守，成為限制民夷出入之要隘。後逐漸成了一個重要關卡，至清代則由幾日開啟一次變成日日開啟的“官關”。1673年（清康熙十二年）改為“關閘汛營”，由前山派兵駐守。至道光年間（1821～1850）林則徐任欽差大臣時，關閘更由重兵鎮守。後來，關閘變成了邊界，不僅限制洋人出入境，更禁止居澳葡萄牙人擅自越過關閘到前山打鳥。1849年的關閘事件中，關閘城樓首次被葡兵佔領，延至1870年（清同治九年），澳葡當局竟將關閘城樓拆毀，夷為平地。蓮花莖古關閘存世近300年，只餘關閘城樓刻着“關閘門”3個字的匾額，迄今仍鑲嵌在民政總署大樓入口大堂的牆上作為古關閘的唯一證物，也成為殖民擴張的歷史見證。

1644年（清順治元年），崇禎帝自盡，明王朝傾覆後，澳門葡萄牙人仍全力支持殘存的南明政權的抗清事業。1645年3月，耶穌會士畢方濟（François Sambias, 1582-1649）奉南明福王之命前往澳門求援，受到澳葡當局的隆重接待。由於福王政府旋即覆亡，畢方濟又向建立在福州的唐王政府表示忠誠，與信奉天主教的太監龐天壽一起去澳門購炮請兵。葡萄牙人予以積極的支持，給他們提供了一批大炮，還選派了300名士兵。唐王政府則同意將對面山下的一塊地方作為耶穌會士陸若漢的墓地，開始了葡人居留對面山的歷史。不久，唐王政府被清軍消滅，龐天壽就帶這支葡萄牙軍隊去投奔建在桂林的桂王政府。葡萄牙的軍事援助對於桂王政府的抗清起了很大的作用，多次擊退清軍，同時，耶穌會士也積極地在南明君主中傳播天主教，南明君主紛紛皈依天主，太后、皇后及太子均入教。1648年（南明永曆二年），久病的太子在受洗後恰好病愈，王太后還派龐天壽前往澳門，請求耶穌會的司鐸們舉行彌撒大祭。10月17日，龐天壽入澳，各炮台鳴炮致敬，修道士們列隊出迎。10月31日，聖保羅教堂為南明王室隆重地舉行彌撒，彌撒結束，澳門總督又設宴款待使者，還贈送火槍100支作為給桂王政府的禮物。桂王政府也因之答應永遠豁免每年500兩的地租銀，並豁免澳葡數年的船舶餉税。澳葡政府與南明政權一直保持着良好的關係，直至桂王政權的最後滅亡。

澳葡總督越權取締議事會的事件。1709年（清康熙四十八年），葡萄牙國王頒佈法令，規定澳門行政權與財政權歸議事會，總督不得干涉，也不得召集市議員開會。1710年，澳門總督戴冰玉（Diogo de Pinho Teixeira）無視國王法令，干涉議事會的選舉。市議員抗議他的非法行為，而戴冰玉卻派兵逮捕議員，迫使議員逃進耶穌會的神學院避難；戴冰玉又召集市民非法選出新的議事會，使澳門出現了兩個議事會。新選出的議員和一些市民也紛紛避入神學院。戴冰玉派兵包圍神學院，並動用戰船火炮轟擊神學院大門。澳門主教出面調停，事態才稍有和緩。6月29日，議事會召開大會，戴冰玉又率兵鎮壓，遭到市民的回擊。他即命令大炮台向議事亭開炮，炸死1人，炸傷多人。澳門主教急忙派神父帶着“聖體”趕到大炮台，迫使戴冰玉下跪祈禱，制止了一場大規模的流血衝突。不久，葡印總督召回戴冰玉，已被迫簽署投降書的市議員才走出神學院，重新行使職權。