踏入清代，澳門海上貿易航線面臨一系列危機︰首先，日本德川幕府於1630年代宣佈“鎖國”政策，禁止葡萄牙人和西班牙人進行貿易和傳教。其後，葡萄牙於1640年因脫離西班牙的統治，使澳門與馬尼拉的航線中斷；翌年，葡萄牙人還失去極為重要的馬六甲港，大大打擊葡萄牙人在東南亞和遠東的貿易。失去日本、馬六甲和馬尼拉，使澳門的貿易大不如前，但更為雪上加霜是清初實施海禁和遷界令，令葡萄牙人在澳門一度無法進行貿易。
直到康熙二十三年（1684）遷海令撤銷，才使澳門的貿易恢復起色。翌年，清廷下令設立四大海關（粵海關、江海關、閩海關、浙海關），並在澳門設立“關部行臺”管理外國貿易。有別於明朝透過葡萄牙人居中買賣，康熙皇帝允許其他外國商團到中國貿易，包括新與的英國和法國商人。乾隆十六年（1751），由於外商來華貿易頻繁，為了方便管理，清廷只保留廣州作唯一的通商港口，外商可在貿易季節在廣州經商，其後必須離開，但允許在澳門“住冬”，使澳門成為各國外商的居留地。
除了貿易上的大轉折，清朝對天主教的態度也有所改變。初期不乏耶穌會士在朝廷為滿清皇族服務，如任欽天監的湯若望、任宮廷畫師的朗世寧等。清初對天主教抱持相對包融的態度，但在18世紀初發生“禮儀之爭”，使清廷與羅馬教廷之間出現嚴重分歧，致使雍正和乾隆年間，朝廷開始實施禁教，甚至派員到澳門拆毀教堂，天主教在內地的傳教事業大受打擊。
鑒於在澳門是“夷人”聚集地和天主教傳播的基地，加人華洋的交流日漸頻繁，時常出現大大小小的紛爭，清廷對澳門的管理也較明代加強，不僅頒布多項章程來規限“澳夷”，同時派遣“澳門同知”和“香山縣丞”加強對居澳葡萄牙人的管治。